过表达miR-378骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

　　miRNAs：是长度为19-25个核苷酸的非编码小RNA分子,通过与靶基因mRNA 3’UTR互补配对,在转录后水平负性调控靶基因的表达,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、周期调控等生物学过程。 血管内皮生长因子、转化生长因子β1等细胞因子发挥心肌修复作用的机制：①抑制缺血区域心肌细胞凋亡,减小心肌梗死面积;②促进局部血管再生,增加心肌灌注;③激活心肌干细胞,增加梗死后心肌细胞再生。

　　中国组织工程研究 第21卷 第9期 2017–03–28出版

　　Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 28, 2017 Vol.21, No.9

　　www.

　　，

　　研究原著

　　张秀敏12，于 波1，李学渊1(1中国医科大学附属第一医院循环内科，辽宁省沈阳市 110001；2抚顺矿务局总医院循环内科，辽宁省抚顺市 113008)

　　引用本文：张秀敏，于波，李学渊. 过表达miR-378骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死[J].中国组织工程研究，2017，21(9):1390-1396. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.015 ORCID: 0000-0002-2645-3900(张秀敏)

　　文章快速阅读：

　　文题释义：

　　miRNAs：是长度为19-25个核苷酸的非编码小RNA分子，通过与靶基因mRNA 3’UTR互补配对，在转录后水平负性调控靶基因的表达，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、周期调控等生物学过程。

　　血管内皮生长因子、转化生长因子β1等细胞因子发挥心肌修复作用的机制：①抑制缺血区域心肌细胞凋亡，减小心肌梗死面积；②促进局部血管再生，增加心肌灌注；③激活心肌干细胞，增加梗死后心肌细胞再生。

　　张秀敏，女，1979年生，辽宁省葫芦岛市人，满族，2003年中国医科大学毕业，副主任医师，主要从事心肌再生研究。

　　通讯作者：于波，博士，教授，主任医师，中国医科大学附属第一医院循环内科，辽宁省沈阳市 110001

　　中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2017)09-01390-07 稿件接受：2017-01-28

　　摘要

　　背景：最近发现，miR-378能调节骨髓间充质干细胞的抗缺氧能力，减轻其在缺氧环境下的凋亡。 目的：观察miR-378过表达骨髓间充质干细胞在大鼠心肌梗死模型中的治疗作用。

　　方法：体外培养至第3代的大鼠骨髓间充质干细胞用反转录病毒感染建立miR-378过表达细胞系。选用成年SD大鼠，结扎前降支制作急性心肌梗死模型，随机分为3组：对照组(n=10)、BMSCnull组(n=16)、BMSCmiR-378组(n=16)。对照组仅注射50 μL生理盐水，后2组梗死局部注射50 μL生理盐水中含1107个空病毒转染和miR-378模拟物转染的骨髓间充质干细胞。移植24 h后，利用TUNEL染色测定移植骨髓间充质干细胞的凋亡率，Western blotting检测移植区域内血管内皮生长因子、转化生长因子β1蛋白表达。移植4周后，利用心脏超声评价心功能，取局部心肌组织行组织学及分子生物学分析。

　　结果与结论：①移植24 h后，BMSCmiR-378组中凋亡细胞明显少于BMSCnull组(n=6，P 0.001)，血管内皮生长因子、转化生长因子β1表达水平明显高于BMSCnull组(n=6，P 0.001)；②移植4周后，BMSCmiR-378组中存活和分化为心肌细胞的骨髓间充质干细胞数量明显多于BMSCnull组(n=10，P 0.001)。与其他2组相比，BMSCmiR-378组中新生血管数量明显增多(P 0.001)；心肌梗死面积明显减小(P 0.001)；左室射血分数明显增加(P 0.05)；左室舒张末容积明显缩小(P 0.05)。BMSCnull组中上述参数明显优于对照组(P 0.05)；③结果表明，miR-378过表达可提高移植骨髓间充质干细胞的抗缺氧能力，继而促进心肌修复。 关键词：

　　干细胞；移植；心肌梗死；骨髓间充质干细胞；miR-378；血管新生；心肌梗死面积；左室射血分数 主题词：

　　心肌梗塞；骨髓；间质干细胞移植；微RNAs；组织工程 基金资助：

　　辽宁省科学技术计划项目(2012225084)；沈阳市科学技术项目(F12-193-9-03、F16-206-9-08)；辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2013316) 缩略语：

　　骨髓间充质干细胞：bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs

　　Zhang Xiu-min, Associate chief physician, Department of Circulatory Medicine, the First Hospital of China Medical University,

　　Shenyang 110003, Liaoning Province, China; Department of Circulatory Medicine, General Hospital of Fushun Mining Bureau, Fushun 113008, Liaoning Province, China

　　Corresponding author: Yu Bo, M.D., Professor, Chief physician, Department of Circulatory Medicine, the First Hospital of China Medical University,

　　Shenyang 110003, Liaoning Province, China

　　The overexpression of miR-378 promotes the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on myocardial infarction

　　Zhang Xiu-min1, 2, Yu Bo1, Li Xue-yuan1 (1Department of Circulatory Medicine, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110003, Liaoning Province, China; 2Department of Circulatory Medicine, General Hospital of Fushun Mining Bureau, Fushun 113008, Liaoning Province, China)

　　P.O. Box 10002, Shenyang 110180 http://www.wendangwang.com 1390

　　miRNAs：是长度为19-25个核苷酸的非编码小RNA分子,通过与靶基因mRNA 3’UTR互补配对,在转录后水平负性调控靶基因的表达,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、周期调控等生物学过程。 血管内皮生长因子、转化生长因子β1等细胞因子发挥心肌修复作用的机制：①抑制缺血区域心肌细胞凋亡,减小心肌梗死面积;②促进局部血管再生,增加心肌灌注;③激活心肌干细胞,增加梗死后心肌细胞再生。

　　张秀敏，等. 过表达miR-378骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死 www.

　　Abstract

　　BACKGROUND: Recently, miR-378 has been shown to modulate the anti-hypoxia capacity of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and reduce cell apoptosis under hypoxic conditions.

　　OBJECTIVE: To investigate the benefits of miR-378-upregulated BMSC transplantation in a rat model of acute myocardial infarction.

　　METHODS: Primary rat BMSCs were cultured in vitro. Until passage 3, the cells were infected with the lentivirus carrying synthetic miR-378 gene fragments. A rat model for acute myocardial infarction was constructed by ligating the left anterior descending artery. Thereafter, the animals were randomly assigned to three groups: control group (n=10), BMSCnull group (n=16) and BMSCmiR-378 group (n=16). In the latter two groups, 50 μL of normal saline

　　containing 1107 empty virus-transfected or miR-378-transfected BMSCs was injected into the region of myocardial infarction, respectively. Only 50 μL of normal saline was injected in the control group. Twenty-four hours later, the apoptosis of transplanted BMSCs was evaluated with TUNEL, and expression level of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-β was detected using western blot assay. Four weeks after treatment, the left ventricular function of rats was assessed by echocardiography, and then histological and molecular biology analyses were performed.

　　RESULTS AND CONCLUSION: At 24 hours postoperatively, there were less apoptotic BMSCs and higher expression levels of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-β in the BMSCmiR-378 group than in the BMSCnull group (n=6, P 0.001). Four weeks later, there were more transplanted BMSCs and BMSCs-derived

　　cardiomyocytes in the BMSCmiR-378 group than the BMSCnull group (n=10, P 0.001). Moreover, increased new vessel density (P 0.001), decreased infarcted area (P 0.001), preserved left ventricular ejection fraction (P 0.05), reduced left ventricular end-diastolic volume (P 0.05) were found in the BMSCmiR-378 group, compared with the other two groups. The above parameters were better in the BMSCnull group than the control group (P 0.05). Overall, the upregulation of miR-378 could enhance the capability of BMSCs against hypoxia, and consequently promote myocardial repair after implantation, providing a new strategy for cell therapy of myocardial infarction.

　　Subject headings: Myocardial Infarction; Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; MicroRNAs; Tissue Engineering

　　Funding: the Science and Technology Plan of Liaoning Province, No. 2012225084; the Science and Technology Plan of Shenyang, No. F12-193-9-03, F16-206-9-08; the Scientific Research Project of Liaoning Provincial Department of Education, No. L2013316

　　Cite this article: Zhang XM, Yu B, Li XY. The overexpression of miR-378 promotes the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on myocardial infarction. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(9):1390-1396.

　　0 引言 Introduction

　　心肌梗死作为冠心病的急性致死并发症，是全球范围内致死和致残的主要疾病之一。经典的冠状动脉旁路移植和经皮冠状动脉介入治疗虽能改善心脏局部血供，但无法使梗死的心肌细胞再生。因此，目前治疗手段无法解决梗死区域收缩能力丧失、心室壁变薄或室壁瘤形成、缺血性心力衰竭等难题[1-4]。

　　近年来，大量研究证实干细胞植入心肌梗死区域能够实现心肌再生、缩小梗死面积、改善心功能[5-7]，因此，干细胞移植一跃成为心肌梗死治疗的研究热点，为心肌的再生治疗带来希望，具有极为广阔的应用前景。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有取材容易、易于扩增、低免疫原性以及具有心肌细胞分化能力等优点，被认为是最有希望的干细胞来源[8-10]。尽管骨髓间充质干细胞移植已经在动物模型中取得了肯定的效果，但研究发现移植1周后的细胞存活率只有不到10%[11-14]，究其原因，心肌梗死局部的缺氧微环境严重限制了骨髓间充质干细胞的存活，是影响其治疗效果的关键因素[15-16]。研究发现，梗死局部氧体积分数为0.2%-1%[17]。骨髓间充质干细胞对缺氧耐受力差，如此低的氧体积分数将导致移植细胞大量死亡[18-19]。因此，增强骨髓间充质干细胞的抗缺氧能力是提高疗效的关键。

　　ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

　　微小RNA(microRNAs)是长度为19-25个核苷酸的非编码小RNA分子，通过与靶基因mRNA 3’UTR互补配对，在转录后水平负性调控靶基因的表达，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、周期调控等生物学过程，故可能成为重要的干预治疗靶点。研究已证实，miR-378不仅能提高细胞存活、促进肿瘤生长和血管新生[20-21]，而且参与心肌细胞多种生物学功能的调节[22-23]。Xing等[24]进一步研究发现，过表达miR-378可减低促凋亡基因肿瘤坏死因子α和TUSC-2的表达，进而抑制缺氧诱导的骨髓间充质干细胞凋亡。据此推测，miR-378过表达可能保护移植的骨髓间充质干细胞，提高治疗效果。

　　为验证这一假说，实验制备急性心肌梗死大鼠模型，然后异体移植过表达miR-378的骨髓间充质干细胞，分别于术后24 h和4周检测骨髓间充质干细胞的凋亡、存活、旁分泌和分化情况，分析新生血管、梗死面积以及心功能变化，以评价过表达miR-378骨髓间充质干细胞在心肌梗死治疗中的作用。

　　1 材料和方法 Materials and methods

　　1.1 设计 完全随机设计，单一样本观察。

　　1.2 时间及地点 实验于2016年1至12月在中国医科大学中心实验室完成。

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